Sekvenování ve Flashi

6. února 2007 manažeři z 454 Life Sciences ukázali 78letému Jamesi Watsonovi první návrh jeho vlastního genomu. Bylo v tom něco přímo poetického. Watson samozřejmě před 45 lety získal Nobelovu cenu za svou roli při objevování dvoušroubovicové struktury DNA; byl také hlavním hybatelem projektu Human Genome Project, který při svém dokončení v roce 2003 utratil téměř 3 miliardy dolarů za 13 let na extrahování plánu, který tyto šroubovice kódují. Nyní se 454 posunul o krok za tento megaprojekt, který shromáždil DNA mnoha lidí, aby určil genetickou sekvenci toho, co se rovná modelovému člověku. Společnost a její takzvaný sekvenační stroj nové generace jednou rukou přečetly genetický kód jednotlivce – takového, jehož práce udělala tolik, aby tento úspěch umožnila.

Jonathan Rothberg ze 454 věří, že jeho stroje učiní sekvenování tak levné a rychlé, že bude praktické číst genomy jednotlivců.

Ale Jonathan Rothberg, který založil 454 v Branfordu, CT, se snem vyrobit sekvenační stroj účinnější než ty, které má k dispozici Human Genome Project, nezmiňuje poezii, když vypráví o svém setkání s Watsonem. Spíše mluví o penězích, rychlosti a budoucnosti, v níž obyčejní lidé nosí své osobní genomy na discích – což je scénář, který je stále více pravděpodobný. Udělat Jima Watsona nás stálo 200 000 dolarů, zdůrazňuje Rothberg. A to jsme dělali většinou v prosinci a lednu.

Tento příběh byl součástí našeho vydání z května 2007

• Viz zbytek čísla
• předplatit

Rothberg, který nyní předsedá správní radě 454, zdůrazňuje, že Projekt Jim zůstává nedokončenou prací a bude vyžadovat více času a peněz. Od února společnost sekvenovala Watsonovu DNA pouze třikrát (každý cyklus zvýšil přesnost a zaplnil mezery); K vytvoření konečného návrhu sekvence projektu Human Genome Project bylo zapotřebí devět průchodů. Ale stejně.

Rothbergova společnost je jen jednou z několika, včetně Illumina ze San Diega a Applied Biosystems z Foster City, CA, vyvíjejících stroje, které dokážou dekódovat DNA rychleji než kdykoli předtím. A stejně jako náklady na napájení počítače prudce klesaly s neustále se zvyšující hustotou tranzistorů na čipech, s příchodem těchto strojů rapidně klesla cena sekvenování DNA. Dnes by cena lidského genomu dekódovaného pomocí sekvenátorů typu používaného v projektu Human Genome Project byla 25 až 50 milionů dolarů. Se stroji nové generace, které jsou dnes k dispozici, klesá na přibližně 1 milion dolarů a do roku 2008 by mohla být až 100 000 dolarů.

Multimédia

• Prohlédněte si grafiku tajemství sekvenování.

Jak ukázala historie počítačů, větší výpočetní výkon za méně peněz může vést k neočekávaným aplikacím. Po projektu Human Genome Project čelili vědci obtížným finančním rozhodnutím o tom, které genomy sekvenovat jako další: šimpanze nebo makaka, krávu nebo delfína, rýži nebo maniok. Nové stroje umožňují sekvenovat téměř vše, co vás zajímá. A jak stále více sekvenčních dat proudí do databází, otevírají se zcela nové oblasti výzkumu. Vědci nyní mají bezprecedentní schopnost provádět srovnání mezi druhy a osvětlit vše od evolučních otázek po genetické důvody individuálních rozdílů v odolnosti a náchylnosti k nemocem. Výzkum prováděný na strojích 454 a publikovaný ve špičkových časopisech zahrnuje částečné sekvenování neandertálského genomu a vývoj nových testů na genetické mutace způsobující rakovinu – technologii, která může lékařům pomoci přizpůsobit léčbu jejich pacientům.

Poslední rok byl nejvzrušujícím obdobím v genomice od dob Projektu lidského genomu, říká Eric Lander, první autor projektu prvního publikovaného návrhu lidského genomu a nyní vedoucí Broad Institute for genomic Medicine v Cambridge, MA. . Sekvenování se stává dostatečně levným a dostatečně výkonným, že jej lze aplikovat na jakýkoli problém. Pole stojí na hlavě. Francis Collins, který vedl projekt lidského genomu pro National Institutes of Health, předpovídá, že nové technologie sekvenování budou mít hluboké důsledky pro budoucnost biomedicínského výzkumu a nakonec i pro praxi medicíny.

Jedinečné řešení
Kancelář Jonathana Rothberga má téma jídelny s červeno-černou šachovnicovou podlahou, červenými chromovanými židlemi potaženými Naugahydem a pohovkou s područkami, které napodobují zadní část Cadillacu z roku 1959, doplněnou o monstrózní ocasní ploutve a zadní světla ve tvaru kulky. . Místo psacího stolu má jídelní bar s barovými stoličkami. Některé police lemují láhve vína z vinice v Connecticutu, kterou vlastní. Za okny leží Long Island Sound. Místo křičí jsem jedinečný . A takový Rothberg je. V roce 1991, když dokončil doktorát z biologie na Yale University, založil CuraGen, jednu z prvních společností, které vyvíjely léky založené na genomice. Kromě CuraGen a 454 Life Sciences založil institut pro studium dětských nemocí a další biotechnologickou společnost, RainDance Technologies, která vyvinula to, čemu říká kapalné obvodové desky, které jsou navrženy tak, aby zefektivnily experimenty manipulací s malými množstvími. tekutiny. A to vše ve věku 43 let.

Ve skutečnosti to byl zájem o jedinečnost každého člověka, který ho nakonec přivedl k tomu, že se pokusil navrhnout sekvenátor, o kterém doufá, že jednoho dne udělá kontroly genomu tak rutinní, jako jsou nyní krevní testy. Rothberg drží vnitřnosti stroje 454, skleněného sklíčka s 1,6 miliony miniaturních jamek, z nichž každá je přibližně 50 mikrometrů široká (asi polovina šířky lidského vlasu) a 55 mikrometrů hluboká. Právě tento čip umožňuje stroji tak rychle sekvenovat DNA, protože v každé jamce může probíhat samostatná chemická reakce.

Sekvenování genů využívá skutečnosti, že dvě vlákna šroubovice DNA jsou komplementární: ze čtyř chemických bází adenin, guanin, thymin a cytosin, které jsou na každém vláknu navlečeny v různém pořadí, se adenin páruje pouze s thyminem a guanin pouze s cytosinem. V nejběžněji používané sekvenační technice, která staví na schématu vyvinutém před 30 lety Frederickem Sangerem z Cambridgeské univerzity, jsou fragmenty DNA separovány do jednotlivých řetězců a vystaveny volným nukleotidům, které se vážou na původní As, Cs, Ts, a Gs pro vytvoření nových komplementárních vláken. Tyto řetězce se liší v délce, protože některé volné nukleotidy byly modifikovány, aby se zabránilo pokračování reakce; když se jedna z těchto bází naváže na svůj cíl, řetězec přestane růst. A každý z těchto čtyř typů terminátorů řetězců má připojený jiný fluorofor, který fluoreskuje, když je zasažen laserovým paprskem. Elektrický proud odděluje vlákna podle velikosti a laser čte barvy, aby určil, která báze byla přidána ke každému řetězci jako poslední, a vysvětlí sekvenci. Naprostá většina laboratoří, které dnes provádějí sekvenování, používá stroj vyrobený společností Applied Biosystems, který chrlí asi dva miliony bází denně.

Nejnovější sekvencer z 454 dokáže přečíst 300 milionů denně.

Metoda 454 se vyhýbá několika časově náročnějším krokům konvenčního sekvenování, jako je separace vláken podle velikosti. Na rozdíl od Sangerova sekvenování neukončuje řetězce: zaznamenává báze, když jsou přidávány do rostoucího vlákna. Nejprve je molekula DNA náhodně nasekána na různé délky. Potom se každý fragment svlékne do jednotlivých pramenů a každý pramen se připojí k samostatnému drobnému korálku. Biochemický proces zkopíruje jednotlivá vlákna, takže z každé kuličky vyčnívá 10 milionů klonů. Každá kulička je poté zabalena do jedné z 1,6 milionu jamek. As, Cs, Ts a Gs promývají jamky postupně, aby se syntetizovaly nové komplementární řetězce.

Zde je skutečně chytrá část: pomocí metody, kterou poprvé popsal Pål Nyrén a spolupracovníci ze Švédského královského technologického institutu, sekvenátor 454 okamžitě zaznamená, kdy je ke každému vláknu přidána báze, a to využitím skutečnosti, že vazebná reakce uvolňuje chemikálii zvanou pyrofosfát. V jamkách stroje 454 je pyrofosfát zachycován chemickou kaskádou, která končí švihnutím enzymu luciferázy (který se přirozeně vyskytuje u světlušek) a vydává záblesk světla. Standardní zařízení s nábojovou vazbou, jaké se používá v digitálních fotoaparátech a dalekohledech, detekuje každý záblesk a odečítá sekvenci As, Cs, Ts a Gs v každém fragmentu. Proces může číst asi 200 až 300 bází v řadě. Stejně jako v konvenčním sekvenování pak počítače hledají odpovídající sekvence na konci jednoho fragmentu a na začátku druhého a spojují fragmenty zpět dohromady ve správném pořadí.

Sekvencer, který 454 uvedl na trh v říjnu 2005, měl několik vážných omezení. Dokázal číst pouze 100 bází v řadě (čím delší je úsek bází v každém sekvenovaném fragmentu, tím snazší je sestavit kompletní genom) a měl také potíže s přesným mapováním opakujících se úseků – řekněme šest As zády k sobě. Ale Rothberg říká, že filozofie 454 byla Get it out early; přijmi to. Společnost se nejprve zaměřila na první uživatele, jako je Broad's Lander, v naději, že brzy zveřejní zjištění, která se spoléhala na sekvencer. Nejprve musíte získat rané lidi, ale ostatní kluci, následovníci, jsou tam, kde je trh, říká Rothberg. A čtou recenzované články.

neandrtálci
Jedním z článků prvního osvojitele, který získal širokou pozornost vědců i veřejnosti, byla studie neandertálské DNA vedená Svante Pääbo z Institutu Maxe Plancka pro evoluční antropologii v Lipsku v Německu. Neandrtálci, kteří jsou moderním lidem nejbližší druh, zmizeli asi před 30 000 lety a o jejich genetickém vztahu k nám je více spekulací než faktů. Ačkoli Pääbo provedl nějaké předchozí studie s neandrtálskou DNA, cokoli nad rámec základní analýzy se ukázalo jako příliš obtížné a nákladné. Problém je v tom, že během tisíců let bylo několik známých vzorků neandrtálské DNA z fosilií degradováno na krátké fragmenty o velikosti přibližně 50 až 75 párů bází. Kromě toho je DNA často kontaminována genetickým materiálem z mikroorganismů a moderních lidí, kteří s fosiliemi manipulovali. Rothberg však věřil, že stroj 454 dokáže analyzovat mnoho krátkých sekvencí při nízkých nákladech a generovat dostatek informací, aby vědci mohli prosít starověké poklady z odpadu. Rothberg chladně zavolal Pääbo, který souhlasil se spoluprací.

Po sekvenování genů ze 70 vzorků kostí a zubů neandertálců našli Pääboův tým a výzkumníci ze 454 jeden vzorek, jehož stáří se odhaduje na 38 000 let a který má většinou čistou DNA. Jak uvedli v novinách zveřejněných loni na podzim Příroda , poté sekvenovali jeden milion párů bází z méně než 200 miligramů materiálu, což je úspěch, který poskytl vodítka o tom, zda se moderní lidé a neandrtálci křížili a kdy se od sebe oba druhy rozcházely. Ještě důležitější je, že článek ukazuje, že sekvenování všech tří miliard bází v neandrtálském genomu je proveditelné. Mohlo by to pomoci vyřešit takové záhady, jako je to, zda mají neandrtálci genetickou schopnost mluvit.

Zjištění, zda se lidé a neandrtálci křížili nebo dokonce měli schopnost spolu mluvit, může získat velkou pozornost tisku a veřejnosti, ale jiné aplikace pro ultrarychlé sekvenování DNA by mohly mít mnohem větší dopad na medicínu a na naše životy. Tradiční metoda sekvenování se dívá na DNA z mnoha různých buněk. Ale pokud je jedna z těchto buněk, řekněme, nádorová buňka, její sekvence se může mírně lišit od sekvence zdravých buněk. V takových případech počítače vyberou sekvenci, která se nejčastěji nachází, a ostatní zahodí. Sekvenátory nové generace, jako jsou ty, které prodává 454, místo toho klonují a sekvenují jednotlivé molekuly DNA, což umožňuje ultrahluboké sondování, které dokáže odhalit vzácné varianty. (Tradiční sekvenátory mohou také analyzovat jednotlivé molekuly, ale je to neúměrně drahé.) Důsledky sekvenování jedné molekuly jsou pro medicínu obrovské. I když není praktické používat konvenční sekvenování k odhalení rozdílů DNA mezi zdravými a nemocnými buňkami, nové stroje mohou takové experimenty snadno provádět.

Matthew Meyerson, klinický patolog z Dana-Farber Cancer Institute v Bostonu, zveřejnil studii, která ukazuje, jak může stroj 454 pomoci odhalit mutace spojené s rakovinou plic. Nyní dostupné léky proti rakovině plic se zaměřují na gen, který Meyerson sekvenuje, a doufá, že lékaři nakonec získají lepší přehled o tom, kdo bude reagovat na které léky, když zjistí, zda má pacient konkrétní mutaci. Představuji si, že za pár let budou mít všichni pacienti s rakovinou své nádory charakterizované sekvenováním jedné molekuly, pokud bude cena technologie nadále klesat, říká.

Ve variaci na toto téma se Michael Kozal, klinik zabývající se AIDS na Yale, spojil s 454, aby provedli ultrahluboké sekvenování HIV, aby určili přítomnost minoritních populací viru odolného vůči lékům. Časné testy této techniky u pacientů odhalily asi dvakrát tolik rezistentního HIV než Sangerovo sekvenování. I tyto informace by mohly lékařům pomoci individualizovat léčebné režimy, což by zvýšilo nákladovou efektivitu. V našem systému je to praktické, říká hlavní vědec 454 Michael Egholm, který spolupracuje s Kozalem. Dříve to prostě nebylo cenově dostupné.

Můj Genom
George Church, průkopník sekvenování na Harvard Medical School, říká, že cena je klíčová. Jak jejich ceny v příštích několika letech klesají, stanou se tyto stroje demokratizační silou, která učiní tradiční sekvencery téměř zastaralými, podobně jako osobní počítače nahradily sálové počítače. A to povede k aplikacím, které zatím nikdo nedokáže pochopit. Pokud bychom stále pracovali se sálovými počítači, mnoho skvělých věcí by se nedělo, říká.

Church, který byl mezi tuctem výzkumníků, kteří v polovině 80. let navrhli Projekt lidského genomu, je jedním z mála biologů, jejichž laboratorní vybavení zahrnuje rukojeť svěráku namontovanou na stole a vrtačku. Zařízení, jako je toto, používá k sestavení vlastních sekvencerů nové generace, kterých má jeho laboratoř v současnosti osm (viz TR35, září/říjen 2006) . Přesvědčen, že společnosti předražují své stroje, se snaží volně sdílet své know-how s případnými kolegy, kteří projeví zájem. Svou filozofii přirovnává k wiki a linuxové mentalitě a říká: Když se sejde parta mravenců, dokážou přemístit kaučukovník.

Churchovou velkou vizí je nasměrovat levnou záplavu As, Cs, Ts a Gs do toho, co nazývá Osobní genomový projekt. V projektu Human Genome Project získali vědci DNA od několika lidí, z nichž každý z důvodu ochrany soukromí zůstává anonymní. Takže poslední sekvence představuje složenou osobu s konglomerátem různých genetických pozadí a lékařských historií. Church chce, aby jeho projekt Personal Genome Project dekódoval DNA jednotlivců, kteří také dobrovolně poskytnou své lékařské záznamy. Všechna výsledná data vyvěsí na internet. Nakonec si představuje, že se do projektu zapojí miliony lidí, kteří zveřejní své sekvence, lékařské záznamy a, pokud se rozhodnou, i fotografie obličejů online. Celý svět pak bude mít přístup ke všem datům, která potřebuje k volnému testování hypotéz.

Přestože Church obdržel od National Institutes of Health značné finanční prostředky na vývoj technologie sekvenování, etické, právní a sociální otázky vznesené osobním Genome Project zabránily NIH v jeho podpoře, a to navzdory kladnému posouzení žádosti o grant v srpnu 2005. Jakmile jsem dostal souhlas, NIH byl celý nadšený, a ne nutně v dobrém smyslu, říká. Pokusil se řešit otázky ochrany soukromí a důvěrnosti a poznamenal, že identita nikoho nemusí být zveřejněna a že NIH již financuje projekty lidské genetiky, které mají méně ochranných opatření.

Church si uvědomuje, že důvěrná znalost jejich vlastní DNA může být pro mnoho lidí příliš. Nenecháte své děti procházet internetové pornografické stránky, říká, a do jisté míry si nedovolíte procházet ty nejděsivější a nejhrubší stránky. Očekává, že místo přístupu k jejich nezpracovaným genomům budou mít lidé profesionály, kteří jim pomohou interpretovat informace.

Navzdory nedostatku federálního financování a etickým námitkám Church postupuje a je přesvědčen, že pokroky v technologii sekvenování poženou myšlenku Projektu osobního genomu vpřed – stejně jako pokroky v informačních technologiích vedly cizince ke sdílení dat způsoby, o kterých se nikomu ani nesnilo. kdy před 30 lety debutoval Apple II s duální disketovou jednotkou. Věří, že jak se sekvencery stanou efektivnějšími, a náklady budou nadále klesat, osobní genomika se rozběhne v měřítku, jaké si dosud jen málokdo dokázal představit.

Výhra v loterii
Loni v říjnu oznámila nadace X Prize Foundation cenu 10 milionů dolarů za produkci vysoce přesných sekvencí 100 lidských genomů za 10 dní nebo méně, aniž by utratila více než 10 000 dolarů za genom. Jedním z prvních účastníků byla společnost 454, která plánuje vyvinout ještě menší kuličky, o kterých doufá, že umožní jejím strojům přečíst ještě více DNA na běh za zhruba stejnou cenu. Nepotřebujeme žádnou novou fyziku ani matematiku, abychom se dostali ke genomu 1000 dolarů, říká Rothberg.

Pomineme-li otázku, kdy – nebo zda-li – někdo získá cenu X, sekvenování DNA bude jistě i nadále prudce klesat v ceně a bude se zvyšovat přesnost. Až do loňského roku se sekvenování skutečně snažilo mít dopad na další éru genomiky, který potřebovalo, říká David Bentley, hlavní vědec společnosti Illumina. Cena tradičního sekvenování v podstatě neklesala dostatečně rychle. Nyní je pole mnohem optimističtější, než bylo, říká. Sekvenování nové generace hraje obrovskou roli.

Slyšet vědce, jak odškrtávají možnosti, je jako poslouchat výherce v loterii. A personalizovaná medicína, jako je typ testování a léčby rakoviny, který Meyerson z Dana-Farber doufá, že pomůže uvést, je jen výchozím bodem. Bentley říká, že nové sekvenátory otevřou okna v rozsáhlých nekódujících oblastech genomu, které zapínají a vypínají geny. Egholm z 454 poznamenává, že projekt Human Genome Project ve skutečnosti nesekvenoval každý poslední kousek lidské DNA; stále mohou existovat neobjevené geny, které může další sekvenování najít. Broad’s Lander si představuje příval nových informací o tom, co vede buňku k diferenciaci na ten či onen typ (ústřední záhada ve vývojové biologii) a co řídí různé buněčné stavy. Uvědomuji si, že je to těžší vysvětlit než vyléčit rakovinu, říká, ale nakonec je to důležitější, protože to ovlivní všechny nemoci.

Lander předpovídá, že během příštího roku budou vědci schopni zahájit studie, které generují terabáze informací – jeden bilion As, Cs, Ts a Gs. Nikdy jsem to slovo ani neřekl terabase před loňským rokem, říká. A pokud jsou všechna tato data na webu a volně dostupná, povede to k úplně jinému druhu biologie.

Jon Cohen, spisovatel na volné noze se sídlem v San Diegu a korespondent pro Věda , pracuje na knize, která se zabývá genetickými rozdíly oddělujícími šimpanze od lidí.

skrýt